酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)免疫學(xué)指標(biāo)*受歡迎、應(yīng)用范圍*廣泛的方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、成本低、環(huán)保且適合大批量人群篩查等優(yōu)點(diǎn)，雖然操作簡(jiǎn)單，但是一些影響因素不容小覷，臨床待檢標(biāo)本常受溶血、黃疸、脂濁、類風(fēng)濕因子、高濃度非特異性免疫球蛋白、藥物、血液抗凝劑及細(xì)菌污染等因素的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果判斷錯(cuò)誤，本文就ELISA 法檢測(cè)的影響因素及相應(yīng)對(duì)策做一綜述，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)是一種特殊的試劑分析方法，在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)，其試劑易于保存、結(jié)果判斷較為客觀，是目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗原抗體*經(jīng)濟(jì)、*普遍的試驗(yàn)診斷方法。其原理是將抗原(抗體)結(jié)合到固相載體表面，再將待測(cè)抗體(抗原)、酶標(biāo)抗原(抗體)與固相抗原(抗體)結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)洗滌使免疫復(fù)合物與待測(cè)抗體(抗原)呈比例，加入酶反應(yīng)底物使其與固相上的酶反應(yīng)變色， 根據(jù)顏色做定性或定量分析，得出檢測(cè)結(jié)果。ELISA 法步驟包括標(biāo)本的采集、保存、加樣、溫育、洗板、顯色、比色以及結(jié)果判斷，臨床采集待檢樣本過(guò)程中常出現(xiàn)溶血、黃疸、脂濁，類風(fēng)濕因子、高濃度非特異性免疫球蛋白、藥物及血液抗凝劑等亦對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。雖然操作簡(jiǎn)單，但還是需要注意一些因素的影響，試劑的選擇、正確的操作、優(yōu)良的儀器都與檢測(cè)結(jié)果密切相關(guān)。本文根據(jù)樣本的影響因素及操作流程中可能出現(xiàn)的相關(guān)問(wèn)題展開(kāi)筆述， 對(duì)ELISA 法檢測(cè)的影響因素及相應(yīng)對(duì)策作一綜述，希望提高ELISA 法檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
1 樣本的影響因素
臨床采取空腹抽取靜脈血清作為ELISA 檢測(cè)標(biāo)本，標(biāo)本采集過(guò)程中很多因素可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，如溶血、脂濁、類風(fēng)濕因子、甲胎蛋白、高濃度非特異性免疫球蛋白、藥物、血液抗凝劑及細(xì)菌污染等。
2 操作的影響因素
2.1 試劑的準(zhǔn)備試劑的質(zhì)量如抗原抗體的純度及親和力、標(biāo)記物的比活性、滴度及特異性等直接影響檢測(cè)結(jié)果，不同廠家試劑敏感性、特異性不盡相同， 對(duì)ELISA 試劑盒應(yīng)正確選擇，定期評(píng)價(jià)并建立科學(xué)的接收標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合常規(guī)血液篩查情況，對(duì)實(shí)際的均一性、適用性、穩(wěn)定性，選出靈敏度、特異度及精密性合適的試劑保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。其次試劑盒的儲(chǔ)存方式、運(yùn)輸條件及有效期均為影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素， 試劑盒一般2~8℃冰箱保存， 注意不要緊貼冰箱儲(chǔ)存室后壁以防止試劑凍結(jié)失效， 可避免使用時(shí)試劑受溫差影響導(dǎo)致酶標(biāo)板上凝集小水珠及反應(yīng)出現(xiàn)溫差而影響抗原抗體的反應(yīng)。使用前需將試劑盒放置37℃恒溫箱溫育30min，且不同廠家、不同批號(hào)的試劑不能混合使用。剩余試劑應(yīng)及時(shí)放入干燥劑密封保存在2~8℃冰箱，試劑打開(kāi)后一周內(nèi)有效，同時(shí)注意做好室內(nèi)質(zhì)檢，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
2.2 樣本的采集、保存及預(yù)處理標(biāo)本的運(yùn)輸及保存、檢測(cè)人員的自身素質(zhì)均可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成不良影響，為避免出現(xiàn)錯(cuò)誤樣品應(yīng)準(zhǔn)確標(biāo)明編號(hào)、種類、受檢者姓名及采集時(shí)間，收集后認(rèn)真核對(duì)，拒收不符合要求的標(biāo)本及申請(qǐng)單， 嚴(yán)格按照拒收制度處理，同時(shí)處理合格標(biāo)本，做好后續(xù)工作，避免延誤導(dǎo)致標(biāo)本出現(xiàn)溶血等其它不良情況。標(biāo)本的預(yù)處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果有非常明顯的影響。標(biāo)本離心需徹底且必須待血液凝固后方能分離血清， 也可在標(biāo)本采集時(shí)使用帶分離膠的采血管提取，使用未混入保存液的血液做檢測(cè)標(biāo)本。在此過(guò)程中保證待檢標(biāo)本新鮮、避免細(xì)菌污染，否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，若不能及時(shí)檢測(cè)可將分離的血清于4℃保存， 超過(guò)一周于-20℃保存，避免反復(fù)凍融，防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果。若血清中含有類風(fēng)濕因子或免疫復(fù)合物也將造成假陽(yáng)性結(jié)果。
2.3 加樣ELISA 檢測(cè)加樣時(shí)應(yīng)垂直將樣本準(zhǔn)確加入微孔底部， 注意避免吸頭碰到酶標(biāo)板上的包
被物，盡量慢吸快放，防止濺出或產(chǎn)生氣泡，避免液體外濺使血清殘留在反應(yīng)壁上。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染，干吸頭每次加樣前在血清中抽吸三次保證吸樣準(zhǔn)確，滴加試劑時(shí)建議先將滴瓶搖勻擠去滴再加樣。加樣前先將微孔板平放在板架臺(tái)上，以免對(duì)洗板機(jī)的自動(dòng)操作帶來(lái)影響， 為了保證加樣的準(zhǔn)確性， 建議使用準(zhǔn)確性高的微量移液器且定期進(jìn)行校正。加樣品稀釋液、酶結(jié)合物應(yīng)用液、底物應(yīng)用液及終止液時(shí)可采用定量多道加液器， 迅速完成加液過(guò)程， 加樣后用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板防止水分蒸發(fā)或雜物進(jìn)入孔內(nèi)， 注意封板膜不可二次利用，避免交叉污染，剩余的微孔板、不干膠或膠帶紙與干燥劑一同保存在備用自封塑料袋中。大批量檢測(cè)大型機(jī)構(gòu)體檢標(biāo)本時(shí)可采用直接加入適量血清的加樣模式， 經(jīng)濟(jì)環(huán)保提高工作效率]。
在實(shí)際操作過(guò)程中， 待檢標(biāo)本和酶標(biāo)志物先后順序加入， 于是在競(jìng)爭(zhēng)法中因?yàn)閮烧叩牟煌瑫r(shí)加入而存在一個(gè)“不公平”競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象，研究表明，競(jìng)爭(zhēng)法ELISA 檢測(cè)受加樣方法的影響存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將標(biāo)本和酶標(biāo)志物先在試管中等量混和均勻后再加入酶標(biāo)板小孔杯中可降低-HBc 檢測(cè)的假陽(yáng)性率。
2.4 溫育
溫育是ELISA 至關(guān)重要的一步，不同的溫育環(huán)境對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響， 操作中應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)控制溫育時(shí)間及溫度， 并注意封閉避免邊緣效應(yīng)。為確保各板溫度都能迅速達(dá)到平衡，不可將反應(yīng)板疊加放置， 設(shè)定的溫度及時(shí)間嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行， 一般加入待測(cè)標(biāo)本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環(huán)境下溫育。因?yàn)楹芏嗪銣叵涞臉?gòu)造，溫度及檢測(cè)的溫度并非酶標(biāo)板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時(shí)建議將溫度計(jì)置于酶標(biāo)板旁，保證酶標(biāo)板旁溫度為37℃。干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。溫育時(shí)間是影響檢測(cè)結(jié)果的一大因素。
2.5 洗板
洗板目的在于將特異性結(jié)合于固相上的抗原(抗體)與溫育過(guò)程中吸附的非特異性成份分離，使免疫復(fù)合物與待測(cè)抗體(抗原)呈一定比例，洗板是否合格直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明控制洗板時(shí)間及洗板次數(shù)，ELISA 檢測(cè)一般用洗滌液洗板3 次，洗滌液應(yīng)嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行稀釋， 洗液應(yīng)注滿每個(gè)微孔并注意洗液不外溢，垂直甩板避免交叉污染，防止出現(xiàn)假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果。使用洗板機(jī)洗板可一定程度上避免環(huán)境污染、提高工作效率，洗滌開(kāi)始時(shí)注意觀察每根吸液針是否一直插入孔底并吸干孔內(nèi)全部液體， 嚴(yán)格按照要求設(shè)置一定的洗板時(shí)間及洗板次數(shù)。洗板過(guò)程中注意沖力大小，避免沖力過(guò)大導(dǎo)致酶結(jié)合物丟失，吸光度值偏低。洗液應(yīng)根據(jù)不同廠家的酶標(biāo)板調(diào)整注水量， 注意不要溢出孔外； 稀釋洗液所用的蒸餾水或去離子水酸堿度適中，使配出的洗液pH 在7.2~7.6 范圍內(nèi)，用非金屬容器保存，保持液體新鮮無(wú)污染、沉淀。洗板結(jié)束后將板拍干， 應(yīng)垂直扣在備好的干凈的吸水紙或毛巾上，且注意每次更新干凈的吸水紙或毛巾。洗板時(shí)還應(yīng)注意以下問(wèn)題：(1) 需每天校正注液量及殘液量， 洗滌后殘液量不得大于2μl；(2)及時(shí)更換破損吸液針，避免破壞底板包被；(3)針對(duì)不同廠家酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度， 避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板；(4)注意調(diào)整洗液量，洗液量過(guò)多將溢出，過(guò)少將達(dá)不到洗滌效果；(5)關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道；(6)
不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用。臨床操作中， 工作人員由于擔(dān)心洗板次數(shù)過(guò)少達(dá)不到去除非特異性物質(zhì)的理想效果而增加洗板次數(shù)，*近研究發(fā)現(xiàn)，隨著洗板次數(shù)的增加樣本檢測(cè)的OD 值降低，造成假陰性結(jié)果及灰區(qū)標(biāo)本的漏檢。
2.6 顯色及結(jié)果判斷
試劑顯色時(shí)A、B 液按順序加入且間隔不超過(guò)10min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。顯色劑不宜過(guò)多，注意避光反應(yīng)。顯色是*后一步溫育反應(yīng)，酶將無(wú)色底物催化反應(yīng)呈有色， 反應(yīng)的溫度和時(shí)間均為影響結(jié)果的重要因素， 目前市場(chǎng)上大多數(shù)進(jìn)口的ELISA 檢測(cè)顯色溫度處于18~30℃。一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，但陽(yáng)性孔會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯色加強(qiáng)。研究表明，顯色溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯影響，顯色溫度不同，試劑檢測(cè)能力差距非常大，溫度低于21℃時(shí)試劑盒對(duì)于質(zhì)控物的檢出能力下降，溫度過(guò)低導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)速率變慢[41]，顯色不充分，
造成低值陽(yáng)性結(jié)果的漏檢， 所以操作中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度。顯色時(shí)間不宜過(guò)短，因?yàn)橐恍┑偷味瓤赡懿荒芗皶r(shí)出現(xiàn)反應(yīng)，造成假陰性結(jié)果。結(jié)果判斷應(yīng)按照說(shuō)明書(shū)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成，研究報(bào)道終止反應(yīng)后的時(shí)間對(duì)OD 值結(jié)果有明顯影響，10~15min陽(yáng)性結(jié)果OD 值逐漸下降，陰性結(jié)果的OD 值有所上升，所以必須嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行。
在加液和混合過(guò)程中產(chǎn)生氣泡、微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起吸光值的升高，易造成假陽(yáng)性結(jié)果，若顯色但酶標(biāo)儀讀值為陰性的灰色值樣區(qū)的樣本不管其是否來(lái)源于高危人群均需復(fù)檢并參考參比試劑。
2.7 其它因素
實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境亦是影響試驗(yàn)結(jié)果的一大因素， 合理控制實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)、采光及防塵，實(shí)驗(yàn)室的溫度及濕度可使用空調(diào)加以控制，濕度控制在35%~65%間，并避免噪音及電磁波干擾。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司