磷酸化的底物

史葛·艾伯林，N維庫馬爾，和邁克爾J韋伯

微生物學(xué)系和癌癥中心，弗吉尼亞大學(xué)衛(wèi)生系統(tǒng)，夏洛茨維爾，弗吉尼亞州22908

摘自蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)相互作用，第二版

編輯golemis和彼得·亞當(dāng)斯·A。

摘要

理想的情況下，人們希望能夠直接磷酸化的基板在一個完整的細胞。這可能是通過引入到居住或透細胞三磷酸腺苷的模擬。然而，細胞是不透水的三磷酸腺苷，并增加標(biāo)記的三磷酸腺苷模擬毛地黃皂苷-透細胞結(jié)果的水解三磷酸腺苷的模擬1分鐘內(nèi)（喬杜里等人。2002。因此，我們選擇了應(yīng)用此技術(shù)的細胞裂解物或分數(shù)。在這里，我們描述的方法直接檢測基板的蛋白質(zhì)激酶。種辦法涉及確定激酶基板immunoprecipitating標(biāo)簽的形式突變激酶轉(zhuǎn)染COS - 1細胞，并執(zhí)行一個激酶反應(yīng)增加γ- [標(biāo)記]三磷酸腺苷的模擬。第二中方法涉及除重組突變激酶和γ- [標(biāo)記]三磷酸腺苷模擬細胞裂解液。我們使用這些技術(shù)的磷酸化ERK 2基板；然而，這種方法可以適用于其他蛋白激酶。

材料（方法Ⅰ和Ⅱ，如上）

緩沖器，解決方案，和試劑

重組激酶（Ⅱ）

[γ- 32 ]三磷酸腺苷的模擬（Ⅰ+Ⅱ）

時凝膠瓊脂糖珠（我）

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（我）

激動劑（我），例如，表皮生長因子，血清，血小板衍生生長因子

國旗平方米瓊脂糖珠（我）

十二烷基硫酸鈉，20%（我）

平方米裂解緩沖液（二）（見議定書1）

公共電視網(wǎng)，室溫（我）和冰冷的（Ⅰ+Ⅱ）（見議定書1）

無血清培養(yǎng)基（我，例如，貝科的介質(zhì)）

旗肽（5毫克/毫升的低滲裂解緩沖液）（我）

激酶緩沖區(qū)含有脒，10毫米和100毫米氯化鈉（二）

2 Laemm li樣品緩沖（我）

低滲裂解緩沖液（我）

20毫米復(fù)（7.4）

2毫米鈣

2毫米氯化鎂

細胞的

1細胞（Ⅰ+Ⅱ）

質(zhì)粒

maxi-prep DNA質(zhì)粒攜帶的抗原表位標(biāo)記版本的野生型和突變形式的激酶的興趣（我）

特殊設(shè)備

組織培養(yǎng)皿（Ⅰ+Ⅱ）

皮下注射針頭的1 / 4，1 ＇，27計（我）

提取柱（我）

透析盒，10000分子量截止（Ⅱ）

SDS -聚丙烯酰胺凝膠（我）

旋轉(zhuǎn)，設(shè)置在冷藏室（4°丙）（我）

沸水浴，預(yù)設(shè)100°丙（我）

孵化器，預(yù)設(shè)37°℃，5%二氧化碳（Ⅰ+Ⅱ）

孵化器，預(yù)設(shè)30°丙（Ⅰ+Ⅱ）

離心冷卻到4攝氏°（Ⅰ+Ⅱ）

方法

方法：磷酸化激酶底物

重要的是規(guī)范的程序在小型反應(yīng)之前，擴大程序識別新型基板。

1×106到100毫米1細胞組織培養(yǎng)菜的前1天轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)細胞在37攝氏°5%二氧化碳。轉(zhuǎn)染的細胞與6µ克質(zhì)粒攜帶抗原表位標(biāo)記版本的野生型或突變形式的激酶的興趣，和24µ升的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，根據(jù)制造商的指示。

24至72小時posttransfection洗兩次，細胞與室溫硫化鉛和serum-starve他們在無血清培養(yǎng)基的4 - 12小時。然后，刺激細胞激動劑5 - 10分鐘。

這取決于激酶正在研究，不同饑餓時間和興奮劑可以用。

洗細胞兩次冷硫化鉛冰。添加低滲裂解緩沖液（0.5毫升/ 100毫米菜）。

低滲裂解緩沖區(qū)是用來保護蛋白相互作用與相關(guān)蛋白。為確定相互作用基板，形成穩(wěn)定的協(xié)會，平方米裂解緩沖液（見議定書1）或另一個緩沖區(qū)與濃度的增加洗滌劑或鹽可以用來（哈洛和1999巷）。

刮的細胞一起和他們轉(zhuǎn)移到1.5毫升微量管。不要渦。溶解細胞的15000g在微量離心在20分鐘在4°C

轉(zhuǎn)移上清（~ 1毫克蛋白）為新管。保持小等分旁白（20µ克）檢查的表達水平的蛋白表達。

洗時凝膠適量的瓊脂糖珠（30µ升/樣本）與低滲緩沖液和混合flag-m2瓊脂糖珠（10µ升/樣本），或珠共軛抗體表位標(biāo)記的另一個選擇（~ 1µ克抗體每1毫克的蛋白質(zhì)裂解液）。

洗混合珠兩次在低滲裂解緩沖液，然后將它們添加到裂解制備步驟5（40µ我每樣本）免疫。孵化珠在裂解液1 - 2小時在4攝氏°不斷旋轉(zhuǎn)。

洗三次免疫沉淀與低滲裂解緩沖液（1毫升每洗每個樣品）。決賽后的清洗，吸剩下的幾滴緩沖使用1個1 / 4英寸，27衡量針。

執(zhí)行激酶反應(yīng)總體積